Si su cultivo presenta síntomas de crecimiento desconocidos, podemos investigar si hay un patógeno, una falta de nutrientes o si otros factores de su explotación están causando los daños. Para realizar el diagnóstico correcto, disponemos de varios métodos analíticos, como la microscopía, los métodos de chapado y los análisis de ADN.

Para realizar un diagnóstico correcto, hay una serie de aspectos de gran importancia, como las condiciones de cultivo, el clima, el origen del material vegetal y la distribución de los síntomas en el cultivo. También es importante enviar las partes correctas de la planta para el diagnóstico.

Investigación microbiológica y métodos de análisis de virus

En esta serie sobre la investigación microbiológica, en el boletín anterior hablamos ampliamente de los análisis sobre los centros germinales. En la próxima edición se hablará de los análisis de ADN de hongos y bacterias patógenos de las plantas. Ahora, la atención se centra en los métodos de análisis de los virus. En este artículo hablaremos del análisis ToBRFV.

Groen Agro Control recibe a menudo preguntas sobre los virus y cómo se realizan los análisis. No existe una prueba universal para analizar los virus en los cultivos. Esto significa que hay que buscar un virus específico cada vez. Cada virus requiere un análisis separado para confirmar o excluir la presencia de este virus en el cultivo.

Como ejemplo, hablamos del cultivo del tomate, pero esta explicación es útil para cualquier cultivo.
En general, el virus en el cultivo puede examinarse bien, y por lo tanto es viable y contagioso. También se puede analizar el agua de desagüe desinfectada, muestras de superficies limpias o ropa lavada para detectar la presencia de virus.
La concentración del virus demostrada puede ser muy baja o puede dejar de ser viable en este tipo de muestras, por lo que un resultado positivo no indica infectividad.
Para determinar si este virus sigue siendo viable (y, por tanto, puede seguir infectando a las plantas) hay que realizar una prueba adicional en las plantas. En los métodos de análisis de virus sólo se puede saber que el virus demostrado sigue vivo en el cultivo vivo. En las muestras descontaminadas puede haber virus muertos, lo que en una prueba de virus da el resultado de ”demostrado”.
En el caso del ToBRFV, es necesario seguir investigando para comprobar la eficacia de los desinfectantes para eliminar este virus persistente.

Virus del fruto rugoso del tomate (ToBRFV)

Desde hace algún tiempo, Groen Agro Control es capaz de proporcionar un análisis rápido y fiable sobre el virus de la rugosa marrón del tomate (ToBRFV). Se ha desarrollado un ensayo específico de PCR en tiempo real que puede aplicarse a diferentes tipos de muestras, como las de cultivos, agua y muestras de superficie. En el caso de las muestras de barrido, se utiliza primero una prueba de planta, tras lo cual se utiliza el método PCR para comprobar si el virus vivo se ha replicado.

A continuación se describen varios métodos de prueba para el ToBRFV en el tomate.

Prueba ELISA

En una prueba ELISA, se utilizan anticuerpos para buscar una proteína de un determinado virus vegetal. Si la proteína se muestra en la muestra (savia de la planta), la prueba finalmente se vuelve amarilla. Sin la presencia de la proteína específica, la prueba permanece incolora.

Para el desarrollo de las pruebas ELISA, dependemos de terceros que desarrollan y suministran estas pruebas. Todavía utilizamos a menudo las pruebas ELISA cuando están disponibles y son suficientemente específicas (buenas).

Para probar el ToBRFV, se puede utilizar:

• ELISA-TMV que también capta la señal del ToBRFV
• ELISA para el grupo Tobamo, que también incluye el ToBRFV.

La prueba ELISA tiene a veces la desventaja de que se necesita una gran cantidad de virus (síntomas) antes de que la prueba indique que el virus está presente. Por lo tanto, el límite de detección es bastante alto, lo que puede ser una desventaja para un buen seguimiento o para hacer un diagnóstico. Durante el periodo de incubación del ToBRFV en la planta, esta prueba podría indicar que no se encontró el virus, mientras que sí estaba presente. Por lo tanto, en nuestro laboratorio se prefiere un método de PCR.

Groen Agro Control dispone de las siguientes pruebas ELISA para el tomate:

El material vegetal necesario es la hoja

• Virus del mosaico del pepino
• Virus de la patata X
• Virus de la patata Y
• Virus del mosaico del tomate
• Virus del mosaico del pepino
• Virus del bronceado del tomate
• Virus del moteado de las impatiens
• Virus del mosaico de la alfalfa

Prueba PCR para el virus

Green Agro Control desarrolló una prueba de PCR en tiempo real para el ToBRFV a finales de 2018 porque es una prueba altamente sensible y, por lo tanto, puede detectar rápidamente niveles bajos de ToBRFV. La prueba sólo reacciona con el ToBRFV y no tiene reacción cruzada con el TMV y el ToMV.

En la prueba PCR, el ARN del virus (cadena simple) debe “transcribirse” en ADN (cadena doble). Podemos analizar muestras de cultivos con esta prueba PCR. Y, con un preprocesamiento adicional, también muestras de barrido, semillas y muestras de agua. Para estas muestras especiales, a menudo se realiza primero una prueba de crecimiento, en la que se infectan las plantas de prueba con la muestra.

Como especialista en el mercado, Groen Agro Control suele ir por delante en el desarrollo de pruebas PCR. Ayudar a los cultivadores rápidamente con las nuevas enfermedades que son prevalentes.

Pruebas PCR para virus específicos en el tomate por Groen Agro Control

• Grupo de tobamovirus
• Grupo de Begomovirus
• Virus del rizado de la hoja amarilla del tomate (TYLCV)
• Virus del fruto rugoso del tomate (TBRFV)
• Virus de la clorosis del tomate (TOCV)

Secuenciación del ADN

Puede haber diferentes cepas del mismo virus, que pueden ser más o menos agresivas para la planta. Esto se hace mediante la secuenciación, que es una forma de trazar el árbol genealógico del virus. En el caso de varios virus, este método se utiliza para determinar la cepa. Pero también se utiliza para aislar bacterias u hongos desconocidos en la planta o en el suelo. Groen Agro Control proporciona este método de secuenciación y dispone de una amplia base de datos para identificar especies y cepas de enfermedades.

Prueba rápida

A veces, los productores quieren poder averiguar rápidamente por sí mismos si ciertos síntomas en el cultivo son causados por el ToBRFV. En el mercado existen las llamadas pruebas rápidas para el tobamovirus, que incluye el ToBRFV. Al parecer, si se realiza dicha prueba tal y como se indica en la etiqueta, se pueden obtener resultados poco claros. A esto lo llamamos resultados falsos positivos o falsos negativos. Por lo tanto, hemos estudiado cómo se puede utilizar correctamente la prueba.

Si la concentración de virus es demasiado alta (demasiada hoja), la prueba dejará de medir correctamente. Entonces puede indicar erróneamente ”no demostrado”. Funciona mejor si primero se diluye más antes de medir. Sin embargo, tampoco es bueno diluir demasiado, ya que de lo contrario el virus dejará de detectarse.

Hemos llegado a una prescripción de uso mejorada: “Protocolo de tiras reactivas TMV para la detección de ToBRFV“. Se sabe que estas pruebas rápidas sólo indican la presencia del virus cuando los síntomas ya son visibles en el cultivo. Así que debería haber una cantidad razonable de partículas de virus presentes en la hoja.

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Foto Agdia strip (bron: GAC)

Dit is voorbeeld van een test-strookje. In dit geval gaf het teststreepje een vaag resultaat.