In deze serie over microbiologisch onderzoek spraken we in de vorige Nieuwsbrief uitgebreid over de analyses op Kiemgetallen. In de volgende editie zullen DNA analyses op plant pathogene schimmels en bacteriën aan bod komen. Nu ligt de focus op analysemethoden op virussen. In dit artikel gaan wij de analyse ToBRFV behandelen.
Groen Agro Control krijgt vaak vragen over virussen en hoe analyses plaatsvinden. Om virus in gewas te testen bestaat geen universele test. Dat betekent dat er steeds naar een specifiek virus gezocht moet worden. Voor elk virus is een aparte analyse nodig om de aanwezigheid van dit virus in gewas te bevestigen of uit te sluiten.
Als voorbeeld bespreken we hier het gewas tomaat maar voor elk gewas is deze uitleg nuttig.
In het algemeen geldt dat virus in gewas goed kan worden onderzocht, en het daarin dan ook levensvatbaar en dus besmettelijk is. Ook ontsmet drainwater, veegmonsters van schoongemaakte oppervlakten of gewassen kleding kunnen geanalyseerd worden op aanwezigheid van virus.
De concentratie van het aangetoonde virus kan erg laag zijn of niet meer levensvatbaar in deze type monsters, waardoor een positief resultaat nog niks zegt over de besmettelijkheid.
Om te bepalen of dit virus nog levensvatbaar (en dus nog planten kan besmetten) dient een extra plantproef te worden uitgevoerd. In de analysemethodes voor virus weet je namelijk alleen in levend gewas dat het aangetoonde virus nog levend is. In ontsmette monsters kan dood virus aanwezig zijn, die in een virustest ”aangetoond” als resultaat aangeeft.
Voor ToBRFV is verder onderzoek nodig om ontsmetters te testen op effectiviteit van afdoding van dit persistente virus.
Tomato Brown rugose fruit virus (ToBRFV)
Sinds enige tijd kunt u bij Groen Agro Control terecht voor een snelle en betrouwbare analyse op Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV). Er is een specifieke real time PCR assay ontwikkeld welke kan worden toegepast op verschillende typen monsters zoals gewas, water en veegmonsters van oppervlaktes. Voor de veegmonsters wordt eerst een planten-test ingezet, waarna met de PCR methode getest wordt of het levende virus zich vermeerderd heeft.
Hieronder zijn verschillende testmethoden voor ToBRFV in tomaat beschreven.
ELISA test
In een ELISA bepaling wordt met antistoffen gezocht naar een eiwit van een bepaald plantenvirus. Als het eiwit aangetoond wordt in het monster (plantensap) dan kleurt de test uiteindelijk geel. Zonder aanwezigheid van het specifieke eiwit blijft de test kleurloos.
Voor de ontwikkeling van ELISA-toetsen zijn we afhankelijk van derden die deze toetsen ontwikkelen en leveren. We maken nog vaak gebruik van ELISA-testen wanneer ze beschikbaar zijn en specifiek (goed) genoeg zijn.
Om ToBRFV te testen kan gebruik gemaakt worden van:
- ELISA-TMV waarmee ook het signaal van ToBRFV wordt opgevangen
- ELISA voor de Tobamo-groep waaronder ook ToBRFV valt
ELISA heeft soms het nadeel dat er al best veel virus (symptomen) nodig is alvorens deze test aangeeft dat het virus aanwezig is. De detectielimiet ligt dus vrij hoog wat een nadeel kan zijn om goed te monitoren of een diagnose te stellen. Gedurende de incubatietijd van ToBRFV in de plant zou deze test kunnen aangeven dat het virus niet gevonden is, terwijl het er wel zat. Daarom gaat in ons laboratium de voorkeur uit naar een PCR-methode.
Groen Agro Control beschikt voor Tomaat over de volgende ELISA-testen:
Benodigd plantmateriaal is blad
- Pepinomozaïekvirus
- Aardappelvirus X
- Aardappelvirus Y
- Tomatenmozaïekvirus
- Komkommermozaïekvirus
- Tomatenbronsvlekkenvirus
- Impatiens-vlekkenvirus
- Alfalfamozaïekvirus
PCR-toets op virus
Groen Agro Control heeft eind 2018 voor ToBRFV een real-time PCR-test ontwikkelt omdat dit een zeer gevoelige test is en dus snel lage hoeveelheden van ToBRFV kan detecteren. De test reageert alleen met ToBRFV en geeft geen kruisreacties met TMV en ToMV.
Bij de PCR-test moet het virus-RNA (enkele streng) worden ‘overgeschreven’ (transcriptie) in DNA (dubbele streng). We kunnen met deze PCR-test gewasmonsters analyseren. En met extra voorbewerking ook veegmonsters, zaden en watermonsters. Voor deze bijzondere monsters wordt vaak eerst een groeitest gedaan, waarbij toetsplanten besmet worden met het monster.
Groen Agro Control loopt als specialist in de markt vaak voorop in de ontwikkeling van PCR-toetsten. Om telers snel te helpen met nieuwe ziekten de heersen.
PCR toetsen voor specifieke virussen in tomaat door Groen Agro Control
- Tobamovirus groep
- Begomovirus groep
- Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV)
- Tomato brown rugose fruit virus (TBRFV)
- Tomato chlorosis virus (TOCV)
DNA- Sequencing
Omdat er van een soort virus verschillende stammen kunnen voorkomen, die meer en minder agressief kunnen zijn voor de plant wordt er wel stam-onderzoek gedaan. Dat gebeurt via zogenaamd sequencing waarmee als het ware de stamboom van de soort in kaart gebracht wordt. Voor verschillende virussen wordt deze methode wel toegepast om de stam te bepalen. Maar ook wordt het gebruikt om geïsoleerde onbekende bacteriën of schimmels in de plant of in de grond te kunnen benoemen. Groen Agro Control verzorgt deze sequencing methode en heeft zelf een grote databank om soorten en stammen van ziekten te kunnen benoemen.
Snel-test
Telers willen soms graag snel zelf kunnen uitsluiten of bepaalde symptomen in het gewas veroorzaakt worden door ToBRFV. In de markt zijn zogenaamde sneltesten beschikbaar voor onder andere Tobamovirus, waar ToBRFV onder valt. Het blijkt dat als je zo’n test doet zoals voorgeschreven op het label, dat je onduidelijke resultaten kunt krijgen. Vals-positieve of vals-negatieve resultaten noemen we dat. Wij hebben daarom bekeken hoe die test wel goed gebruikt kan worden.
Wanneer de virusconcentratie te hoog is (teveel blad), dan meet de test niet goed meer. Dan kan er onterecht ”niet aangetoond” aangegeven worden. Het gaat beter als er eerst meer verdunt wordt voordat je meet. Echter is teveel verdunnen ook niet goed, anders wordt het virus niet meer gedetecteerd.
We zijn gekomen tot een verbeterd voorschrift voor het gebruik: ”Protocol TMV teststripjes voor ToBRFV detectie”. We geven echter geen garantie omdat wij zelf deze methode niet hanteren. Deze tests staan erom bekend dat ze pas aangeven of er virus aanwezig is wanneer er reeds echte symptomen in het gewas zichtbaar zijn. Dus deze test gebruiken als tool om het gewas te monitoren, lijkt niet zinvol.
Foto Agdia strip (bron: GAC)
Dit is voorbeeld van een test-strookje. In dit geval gaf het teststreepje een vaag resultaat.